Nature Biotechnology发表观点文章：人源VLP递送RNA的应用潜力

细胞与基因治疗领域 2022-06-21

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在本次席卷全球的新冠疫情推动下，mRNA疫苗快速研发，mRNA治疗技术及相关药物研发受到全球科学家们的广泛关注。在从疫苗到蛋白质替代疗法的应用中，RNA正在成为一种强大的治疗方式。然而，在疫苗以外的许多应用中，临床开发的一个主要障碍是缺乏将RNA输送到特定组织和细胞的有效方法。在《科学》杂志最近的一篇论文中，Segel等人报告了一种从人类基因组借用的新型RNA递送策略¹。该方法使用来自人类逆转录病毒的蛋白质，该蛋白质具有包装其RNA并将其以病毒样颗粒(VLP)形式运输到细胞外的罕见能力。作者表明，他们的方法称为“选择性内源性衣壳化的细胞递送”（SEND），能够在不使用非人类成分的情况下将外源性mRNA 组分（例如 Cre 和 Cas9）递送到体外细胞中。尽管这种交付策略仍处于起步阶段，但作为一个完全人性化的系统，SEND可能被证明是比当前方法更安全的替代方案。

目前，最广泛使用的RNA递送载体是脂质纳米颗粒（LNP）。脂质纳米颗粒推动了SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的显著成功，但对于其他应用，它存在着一些缺点。其中包括在重复给药和跨越生物屏障以靶向特定细胞类型方面有着安全性差、有效率低等问题。

整合到整个人类基因组中的病毒序列提出了一个诱人的可能性，即可以利用它们的自然功能来提供治疗性RNA。逆转录基因约占人类基因组的8%2 。尽管大多数内源性逆转录病毒基因已经失去功能，但仍有一些在人体生理学中发挥作用。据报道，一些逆转录元件保留了一些古老的功能，例如结合和转移mRNA以及在细胞内形成衣壳。

为了找到适合RNA传递的候选逆转录基因，Segel 等人调查了保守的内源性逆转录元件，重点关注包含核心衣壳结构域的结构逆转录病毒Gag蛋白的同源物。该结构域通过形成VLP来保护逆转录转座子和逆转录病毒的基因组，这表明包含它的蛋白质可能能够转移其他 RNA。研究者将搜索范围缩小到在人和小鼠之间保守且具有可检测RNA水平的蛋白质，因为这些蛋白质更有可能在哺乳动物细胞中保留了某些功能。他们筛选了在细菌和哺乳动物细胞中的主要命中结果，以确定它们是否以VLP的形式分泌到细胞外囊泡中。VLP部分中最高度富集的蛋白质是小鼠（Mus musculus ) PEG10，也在小鼠血清中以可观的水平检测到。此外，由PEG10蛋白形成的VLP包含全长Peg10 mRNA转录本。

为了研究这些小鼠PEG10 VLP是否可以掺入无关的RNA，Segel 等人将Cre重组酶编码序列与Peg10 5'和3'非翻译区(UTR)连接起来，并将构建体与PEG10一起共转染到Neuro2a小鼠神经母细胞瘤细胞中。他们还通过添加融合素水疱性口炎病毒包膜蛋白(VSVg)来设计VLP，以促进细胞递送。引人注目的是，带有VSVg的PEG10 VLP被分泌到细胞外囊泡中，并将Cre mRNA转移到loxP-GFP细胞中（图1）。这一观察结果表明添加Peg10mRNA载体的UTR使 PEG10 VLP能够转移选择的mRNA，并且病毒融合蛋白是细胞进入所必需的。与小鼠直向同源物类似，人类PEG10可以形成VLP并转移mRNA。

图 1：来自内源性逆转录元件的病毒样颗粒递送 mRNA 组分。

“选择性内源性衣壳化的细胞递送”（SEND）系统的示意图。PEG10、RNA组分和融合素载体被转染到细胞中。在细胞内，PEG10 蛋白包装货物mRNA并组装成病毒样颗粒(VLP)，然后分泌到细胞外囊泡中的生长培养基中。然后收集培养基并通过超速离心分离VLP。最后，用VLP转染靶细胞。

这种PEG10、修饰的mRNA和融合素的组合形成了SEND系统。为了使系统完全内生，Segel等人评估了可能替代VSVg的鼠类和人类融合剂。他们专注于合胞素，这是一种从逆转录病毒元件进化而来的内源性融合跨膜蛋白，已被用于假型慢病毒以进行核酸递送。作者发现，小鼠SYNA和SYNB中的融合合胞素蛋白与小鼠PEG10具有相似的表达模式，并且小鼠SYNA可以成功取代VSVg，将Cre mRNA 转移到尾尖成纤维细胞。人类合胞素（ERVW-1和ERVFRD-1）以类似的方式运作，这将SEND确立为一个至少在体外被认为是完整的人类功能基因转移系统。

为了测试SEND的模块化，研究人员还使用它来传递大的SpCas9 mRNA，并通过评估Neuro2a小鼠神经母细胞瘤细胞中的基因破坏来测试其功能，该细胞组成性表达针对Kras的单向导RNA (sgRNA) 。SEND系统传递了Cas9 mRNA组分，并在受体细胞的Kras基因座中引起了显着的60%基因编辑。然而，SEND未能将 sgRNA组分输送到表达Cas9的细胞。因此，作者将sgRNA和Cas9 mRNA结合起来创建了一个多合一的载体。该载体使用小鼠SEND 系统促进了Neuro2a细胞中30% 的Kras基因编辑，使用人类SEND系统促进了HEK293细胞中40%的VEGFA基因编辑。

Segel 等人的研究（图1）是第一个能够包装、分泌和递送特定 mRNA的内源性系统的例子。在可以设想实际用途之前，需要进行广泛的测试。SEND系统仅在体外进行了研究，还必须在体内进行评估。正如之前的报道3，小鼠PEG10在胎盘和神经元发育中具有多种作用，尚不清楚添加外部PEG10蛋白是否会影响其天然功能。其他问题涉及内源性蛋白质在不同生物环境中表达时可能的自身免疫反应，以及生物分布、毒性、功效和可扩展性。

未来还应该对SEND系统与现有mRNA递送系统进行比较，包括 SARS-CoV-2疫苗中使用的脂质纳米颗粒以及目前临床测试中的许多其他方法4,5,6。重要的是要了解SEND系统是否具有内在的细胞类型特异性，以及这种特异性是否可以被设计。下一代脂质纳米颗粒包括靶向策略，这些策略最近在炎症、癌症和遗传疾病的各种动物模型中显示出细胞类型特异性、有效性和安全性，单独使用mRNA或与sgRNA结合使用来敲除癌症基因7,8,9,10 。尽管如此，SEND系统可能会成为更安全、更有效的替代方案。在未来，经过进一步发展，SEND系统可能在解决生物学问题、提供疫苗和治疗疾病等方面更具优势，特别是在需要终身治疗的慢性病方面更有潜力。

报道来源：

Gutkin, A., Rosenblum, D. & Peer, D. RNA delivery with a human virus-like particle. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01124-x

原文引用

1. Segel， M. et al. Science 373， 882–889 （2021）.

2. Feschotte, C. & Gilbert, C. Nat. Rev. Genet. 13, 283–296 (2012).

3.Ono, R. et al. Nat. Genet. 38, 101–106 (2006).

4.Baden, L. R. et al. N. Engl. J. Med. 384, 403–416 (2021).

5.Polack, F. P. et al. N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615 (2020).

6.Rosenblum, D., Gutkin, A., Dammes, N. & Peer, D. Adv. Drug Deliv. Rev. 154-155, 176–186 (2020).

7.Kedmi, R. et al. Nat. Nanotechnol. 13, 214–219 (2018).

8.Veiga, N. et al. J. Control. Release 313, 33–41 (2019).

9.Rosenblum, D. et al. Sci. Adv. 6, eabc9450 (2020).